Pasos PCR

1. Desnaturalización: Dos pequeños fragmentos de ADN, típicamente de 10 pares de bases, llamados primers, son sintetizados a través de otra técnica. Esos primers son pequeños fragmentos de ADN que son complementarios a cada una de las extremidades de la secuencia de ADN de interés. En un tubo de reacción son adicionados los primers, nucleótidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina, guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especial resistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la síntesis de ADN. La mezcla es calentada a 95°C lo que provoca la separación de las dos cadenas de ADN.

2. Alineamiento: Unión de la sonda a la secuencia diana: El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar una secuencia específica de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en un organismo.

Los iniciadores o primers son secuencias sintéticas cortas (de 20 a 30 bases) que se unen a cada una de las dos hebras simples del ADN desnaturalizado. La alineación generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. El control preciso de la temperatura y el adecuado diseño de los iniciadores permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.

3. Extension: Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y una enzima comienza a unir los nucleótidos que faltan para sintetizar la región marcada por los iniciadores y producir dos nuevas hélice de ADN de doble hebra, ambas idénticas al original.

Este ciclo se repite numerosas veces.  Al final de cada ciclo cada una de las secuencias de ADN recién sintetizadas sirve como patrón para el siguiente ciclo, por lo que después de 30 ciclos se han creado millones de copias del ADN original. El resultado es el acumulamiento de productos específicos de la PCR.